經聚乙二醇雙性高分子修飾之胰凝乳蛋白脢的熱穩定性

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研究生：	陳建誠 CHIEN-CHENG CHEN
論文名稱：	經聚乙二醇雙性高分子修飾之胰凝乳蛋白脢的熱穩定性 Thermostability of α- chymotrypsin modified by Poly(ethylene glycol)-Cotaining Amphiphilic Graft Copolymers
指導教授：	陳崇賢 Chorng-Shyan Chern
口試委員:	李振綱 Cheng-Kang Lee 邱信程 Hsin-Cheng Chiu
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	工程學院 - 化學工程系 Department of Chemical Engineering
論文出版年：	2009
畢業學年度：	97
語文別：	中文
論文頁數：	108
中文關鍵詞：	熱穩定性、胰凝乳蛋白脢、雙性高分子
外文關鍵詞：	α- chymotrypsin, PAAc, PNAS
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　　本研究以酯交換反應合成一雙性高分子，是以具有酸鹼敏感性聚丙烯酸（PAAc）為主鏈，聚乙二醇（PEG）作為高分子之側鏈，此雙性高分子則可作為酵素（α-chymotrypsin）接枝之載體。
　　本論文針對胰凝乳蛋白酵素接枝於高分子前後、接枝於高分子含量多寡及在不同溫度下進行催化反應之比較，分別以N-Benzoyl-L-Tyrosine ethyl ether（BTEE）小分子基質、Azocasein大分子基質及BSA大分子基質，與酵素進行催化水解反應。結果發現在小分子基質下，高分子載體中PEG含量增加時，則酵素的剩餘活性相對提高，但酵素的剩餘活性會隨溫度升高而降低；而在Azocasein 大分子基質及BSA大分子基質作用下，酵素會因接枝於高分子中PEG的含量，影響催化作用的分解速率，當PEG含量持續增加反而因立體排斥效應，使酵素不易與大分子基質結合因而影響水解速率；當酵素在低的pH值環境下，進行熱穩定失活反應，酵素不易失活；未經接枝與接枝之酵素，皆會隨著熱穩定時間的增加，使酵素活性隨之下降。經由大、小基質於催化水解反應下之現象差異，了解酵素、載體與基質間各種作用力的消長。

Amphiphilic copolymers comprising poly(acrylic acid) (PAAc) as the backbone and monomethoxy poly(ethylene glycol) (mPEG) as the grafts were synthesized and characterized. The copolymers were used for conjugation with different amounts of α - chymotrypsin immobilized enzyme system.
In this study, it was intended to investigate the activity of enzyme after grafting toward high and low molecular weight substrates. N-Benzoyl-L-Tyrosine ethyl ether was used as a low molecular weight substrate whereas bovine serum albumin and Azocasein was used as a high molecular substrate. Residual activity increased with increasing the mPEG amount when a low molecular weight substrate was used. But enzyme's residual activity was reduced along with temperature increment. The cleavage rate of bovin serum albumin and Azocasein was reduced due to the excess amounts of mPEG that would induce steric effect, there by leading to slow cleavage rate. When the enzyme was under the low pH environment, it was not easy for enzyme to undergo thermal deactivation.

目　錄
第一章　緒論........................................................1
　1-1　研究背景與目的...............................................1
　1-2　研究內容簡介.................................................2
第二章　文獻回顧....................................................3
　2-1　雙性高分子...................................................3
　2-2　高分子微胞在藥物控制釋放之應用...............................5
　2-3　高分子微胞材料之選擇.........................................8
　2-4　聚丙烯酸之特性...............................................9
　2-5　聚乙二醇之特性...............................................10
　2-6　α-chymotrypsin之性質.........................................11
　2-7　酵素固定化...................................................15
　　2-7-1　固定化酵素之性質.........................................15
　2-8　蛋白質分解酵素對蛋白質之催化作用.............................16
　　2-8-1　酵素催化機制.............................................18
第三章　實驗藥品與方法..............................................20
　3-1　實驗藥品.....................................................20
　3-2　實驗儀器及設備...............................................25
　3-3　實驗流程.....................................................27
　3-4　合成步驟.....................................................28
　　3-4-0　雙性高分子合成與蛋白質接枝反應...........................28
　　3-4-1　N-acryloxysuccinimide 之合成.............................30
　　　3-4-1-1　NAS鑑定..............................................31
　3-4-2　Poly N-acryloxysuccinimide 之合成..........................32
　3-4-3　mPEG-NH2 之合成............................................33
　　3-4-3-1　mPEG-Cl 之改質.........................................33
　　3-4-3-2　mPEG-N3 之合成.........................................35
　　3-4-3-3　mPEG-NH2 之合成........................................35
　　3-4-3-4　mPEG-NH2 轉化率測定....................................36
　3-4-4　PNAS-mPEG 之接枝反應.......................................37
　3-4-5　PNAS-mPEG 之水解反應.......................................38
　3-4-6　PNAS-mPEG與α-chymotrypsin 之接枝反應.......................40
　3-5　雙性高分子之性質鑑定.........................................42
　　3-5-1　Poly(NAS) 之性質分析.....................................42
　　3-5-2　接枝高分子之組成測定.....................................42
　　3-5-3　接枝高分子之官能基測定...................................43
　　3-5-4　PAAc-mPEG-ChT之性質鑑定..................................43
　　　3-5-4-1　Bio-Rad蛋白質濃度分析................................43
　　　3-5-4-2　蛋白質定性分析.......................................44
　3-5-5　活性分析...................................................45
　　3-5-5-1　小分子活性分析.........................................45
　　3-5-5-2　大分子活性分析.........................................46
　3-5-6　PAAc-mPEG-ChT 對蛋白質基質之動力學測定實驗.................47
第四章　結果與討論..................................................48
　4-1　1H-NMR 光譜分析..............................................48
　　4-1-1　反應單體之 1H-NMR 光譜分析...............................48
　　4-1-2　雙性高分子之組成測定.....................................50
　4-2　FTIR光譜分析.................................................54
　4-3　Bio-Rad蛋白質濃度分析........................................61
　　4-3-1　酵素固定化高分子後各組成之分析...........................62
　4-4　凝膠滲透層析（GPC）..........................................63
　4-5　SDS-PAGE分析.................................................65
　4-7　活性分析.....................................................66
　4-8　胰凝乳蛋白酵素與蛋白質催化作用之動力學.......................71
第五章　結論與建議..................................................76
　5-1　結論.........................................................76
第六章　參考資料....................................................78
附錄　Ａ　高分子性質之計算..........................................82
附錄　Ｂ............................................................89




圖 目 錄
圖 2-1　雙性高分子在水中微胞化過程..................................4
圖 2-2　化學鍵結包覆藥物之示意圖....................................6
圖 2-3　殼層具PEG chains之高分子微胞與蛋白質間的作用示意
　　　　圖..........................................................7
圖 2-4　聚丙烯酸結構對不同pH值之變化................................19
圖 2-5　α-chymotrypsin活化之過程....................................13
圖 2-6　α-胰凝乳蛋白分解酶三級構造..................................12
圖 2-7　胰凝乳蛋白分解酶Aα之分子構造................................14
圖 2-8　牛血清蛋白（BSA）之胺基酸序列...............................17
圖 2-9　胰凝乳蛋白酶之催化機制......................................19
圖 3-1　NAS製備裝置.................................................31
圖 3-2　PNAS合成裝置................................................33
圖 3-3　mPEG-Cl製備裝置.............................................34
圖 3-4　超過濾裝置..................................................39
圖 3-5　BTEE水解反應................................................46
圖 4-1　NAS之1H-NMR光譜圖...........................................48
圖 4-2  mPEG-NH2之1H-NMR光譜圖......................................49
圖 4-3　PAAc-mPEG 10 mol% 之1H-NMR光譜圖............................50
圖 4-4　mPEG之1H-NMR光譜圖檢量線....................................51
圖 4-5　NAS之特性吸收波峰光譜圖.....................................54
圖 4-6　poly（NAS）之特性吸收波峰光譜圖.............................55
圖 4-7　mPEG-NH2之特性吸收波峰光譜圖................................56
圖 4-8　PNAS-mPEG 10 mol% 之特性吸收波峰光譜圖......................57
圖 4-9　PAAc-mPEG 10 mol% 之特性吸收波峰光譜圖......................58
圖 4-10　Chymotrypsin之特性吸收波峰光譜圖...........................59
圖 4-11　PAAc-mPEG 10 mol% - ChT 之特性吸收波峰光譜圖...............60
圖 4-12　Chymotrypsin檢量線.........................................61
圖 4-13　PAAc-mPEG 10 mol% - ChT之GPC譜圖...........................63
圖 4-14　PAAc-mPEG 10 mol% 之GPC譜圖................................64
圖 4-15　Chymotrypsin之GPC譜圖......................................64
圖 4-16　10% SDS-PAGE...............................................65
圖 4-17　10 % SDS-PAGE..............................................65
圖 4-18　在小分子下不同溫度之體積活性...............................68
圖 4-19　在大分子下不同溫度之體積活性...............................69
圖 4-20　在小分子下不同溫度之剩餘活性...............................69
圖 4-21　在大分子下不同溫度之剩餘活性...............................70
圖 4-22　在chymotrypsin下不同溫度對BSA基質之水解成度................73
圖 4-23　在PAAc-mPEG 5 - ChT下不同溫度對BSA基質之水解成
　　　　度..........................................................73
圖 4-24　在PAAc-mPEG 10 - ChT下不同溫度對BSA基質之水解成
　　　　度..........................................................74
圖 4-25　在室溫（25℃)下不同酵素固定化對BSA基質之水解成度...........74
圖 4-26　在37℃下不同酵素固定化對BSA基質之水解成度..................75
圖 4-27　在37℃下不同酵素固定化對BSA基質之水解成度..................75
圖 A-1　NAS水解檢量線...............................................83
圖 B-1　mPEG-Cl之特性吸收波峰光譜圖.................................89
圖 B-2　mPEG-N3之特性吸收波峰光譜圖.................................90
圖 B-3　PNAS之1H-NMR光譜圖..................................................................91

表 目 錄
表 3-1　雙性高分子之合成配方........................................38
表 3-2　SDS-PAGE膠片配方............................................45
表 4-1　高分子產物之組成............................................53
表4-2  酵素經固定化後產物之各組成重複單元數（units）................62
表 4-3　BSA 反應 24 hr 後之水程度（％）.............................72
表 A-1　雙性高分子之相對平均分子量..................................82
表A-2  PNAS、PNAS-mPEG之NAS殘量.....................................84
表 A-3　PNAS-mPEG之相對平均分子量...................................85
表 A-4　由Bio-Rad染色法求得產物（1 mg / ml）之蛋白質濃度............86
表 A-5　經酵素固定化後高分子與酵素之莫耳比..........................87
表 B-1  產物在不同溫度下之最大初始速率（Vmax）（1 / sec）...........93
表 B-2　產物在不同溫度下之剩餘活性（%）.............................93
表 B-3  產物在不同溫度下之體積活性（units / ml）....................93
表 B-4  產物在不同溫度下之比活性（units / mg）......................94

Scheme
Scheme １　雙性高分子合成與蛋白質接枝反應之流程.....................29
Scheme 2　N-acryloxysuccinimide 之製備流程..........................30
Scheme 3　Poly N-acryloxysuccinimide 之合成.........................32
Scheme 4　mPEG-Cl之改質.............................................33
Scheme 5　mPEG-N3之改質.............................................35
Scheme 6　mPEG-NH2之改質............................................35
Scheme 7　PNAS-mPEG之接枝反應流程...................................37
Scheme 8　PNAS-mPEG之水解反應.......................................38
Scheme 9　PNAS-mPEG與α-chymotrypsin之接枝反應流程...................40

                                

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全文公開日期 2014/07/23 (校內網路)
全文公開日期本全文未授權公開 (校外網路)
全文公開日期本全文未授權公開 (國家圖書館：臺灣博碩士論文系統)

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