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研究生: 陳信中
SHEN-JHONG CHEN
論文名稱: 利用大腸桿菌生產藍藻蛋白之評估
assessment of cyanophycin production from Escherichia coli
指導教授: 曾文祺
Wen-Chi Tseng
口試委員: 廖本瑞
Ben-Ruey Liaw
方翠筠
Tsuei-Yun Fang
鄭如忠
Ru-Jong Jeng
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 工程學院 - 化學工程系
Department of Chemical Engineering
論文出版年: 2009
畢業學年度: 97
語文別: 中文
論文頁數: 92
中文關鍵詞: 藍藻蛋白大腸桿菌
外文關鍵詞: Escherichia coli, cyanophycin
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藍藻蛋白(cyanophycin),是一存在於藍藻菌中,作為能量,碳和氮來源的包涵體(inclusion body)。本實驗除了生產藍藻蛋白並分析組成,也對藍藻蛋白的物性做測定並嘗試將藍藻蛋白製成薄膜,並分析其成膜後的特性。
在使用基因重組的大腸桿菌生產藍藻蛋白的過程中,可藉由外加胺基酸來提高產率,產率會由1.3%~1.4% (w/w)提升至3.5%。再使用酸萃取法,溶出堆積在菌體中的藍藻蛋白。最後使用逆向高壓層析法分析其胺基酸組成。
經分析後,藍藻蛋白的胺基酸組成為精胺酸(arginine):天冬門胺酸(aspartic acid)約為1:1,並含有極少量的離胺酸(lysine)。另外,藉由蛋白質電泳,可略估分子量約為24.4kDa~30kDa。
物性測定項目有微差掃瞄熱卡計分析(Differential Scanning Calorimeter)、傅立葉轉換紅外線光譜(Fourier Transform Infrared Spectrometer)分析以及熱重分析(Thermogravimetry Analysis),經測定後可知藍藻蛋白的熔點約為194°C,且裂解溫度為246.9°C。且外加胺基酸並不影響藍藻蛋白的物性。
對於其成膜的物性,測量部份包含接觸角、減弱全反射兩部份。
發現以0.1N HCl作為溶劑的接觸角約為63°,而以0.1N HCl :甲醇=1:1做為溶劑的接觸角為66°,且成膜後官能基不變。
另外,也試著使用外加不同莫爾比率的胺基酸來改變藍藻蛋白的組成,不過藉由DSC和蛋白質電泳分析來看,對藍藻蛋白的組成並沒有影響。


Cyanophycin is a water-insoluble reserve polymer of cyanobacteria, and is a product of nonribosomal peptide synthesis. We used recombinant Escherichia coli to produce cyanophycin, and extracted cyanophycin from the cells by the acid extraction method, and then analyzed its amino acids composition by high performance liquid chromatography.
In order to increase the cyanophycin yield, we supplemented additional amino acids in the medium when induction. After the addition of amino acids, the yield increased from 1.3~1.4% (w/w) to nearly 3.5% (w/w).
The results of high performance liquid chromatography analysis showed that the composition of amino acids is arginine : aspartic acid approximately 1 : 1, and the content of lysine is very low, almost undetectable.
Another aim of this study is to measure the physical properties of cyanophycin. We used differential scanning calorimeter, fourier transform infrared spectrometer and thermogravimetry analysis. We found the melting point of cyanophycin is approximately 196°C, and pyrolysis temperature is 246°C.
We also used cyanophycin to prepare membranes, and used fourier transform infrared spectrometer to analyze its function groups. We found that the spectra of the cyanophycin powder and membrane are almost the same. The contact angle of cyanophycin membrane prepared with 0.1N HCl is 63°, and the contact angle of cyanophycin membrane prepared with 0.1N HCl / methanol is 66°.
We also added amino acids in different ratios. The analysis of differential scanning calorimeter and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis showed that different ratios had no effect on the structure of chyanophycin.

壹、緒論 12 1.1 前言 12 1.2 研究動機 13 貳、文獻回顧 14 2.1 基因重組技術簡介 14 2.2 pET表現系統的介紹 15 2.3 T7核醣核酸聚合對寄主細菌的影響 17 2.4 pET表現系統的控制 18 2.5 藍藻蛋白簡介 18 2.6 藍藻蛋白合成 21 2.7 藍藻蛋白的商用化和經濟展望 21 2.8. 使用植物製造藍藻蛋白 24 2.9. 回收藍藻蛋白的方法 25 2.10. 胺基酸衍生分析法 27 參、實驗方法 37 3.1. 實驗藥品和儀器設備 37 3.1-1 實驗藥品 38 3.1-2 儀器設備 41 3.2. 菌株、質體、菌株培養條件 42 3.3 菌體培養步驟 42 3.4 藍藻蛋白(cyanophycin)純化方法 43 3.5 蛋白質電泳分析 45 3.5.1 電泳前處裡 45 3.5.2. 蛋白質電泳 45 3.6 產物中胺基酸組成分析方法 45 3.6.1 產物水解 46 3.6.2. 產物柱前分析反應 46 3.6.3. HPLC條件 47 3.7 外加胺基酸以提高產率 47 3.7.1 菌體培養步驟 48 3.8 外加不同比率胺基酸 49 3.8.1 菌體培養步驟 50 3.9 熱重/熱示差分析 51 3.10 微差掃瞄熱卡計分析 51 3.11 傅立葉轉換紅外線光譜 52 3.12 藍藻蛋白成膜試驗 53 3.13 薄膜接觸角測量 53 肆、實驗結果與討論 54 4.1 藍藻蛋白的生產 54 4.1.1. 基因重組的大腸桿菌的生長 54 4.1.2. 使用異丙基-D-硫代半乳糖的誘導濃度 55 4.1.3. 用酸萃取法由菌體中取得蛋白質 55 4.1.4. 產物蛋白質電泳 56 4.2. 使用逆向高壓層析法分析產物胺基酸組成 57 4.2.1. 逆向高壓層析法分析 57 4.3. 藍藻蛋白的物性分析 58 4.3.1. 熱重/熱示差分析 58 4.3.2. 傅立葉轉換紅外線光譜分析 59 4.3.3. 微差掃瞄熱卡計分析 60 4.3.4. 成膜接觸角的測量 62 4.4. 外加胺基酸測試 62 4.4.1. 外加胺基酸以提高產率 62 4.4.2. 外加不同莫爾比率胺基酸 64 伍、結論 66 Reference 67 附錄 69 圖目錄 圖1 :pET質體的示意圖。 16 圖2 :使用大腸桿菌BL(DE3)作為宿主細胞的示意圖。 17 圖3 :藍藻蛋白的結構示意圖 19 圖4 :AQC方法分析標準胺基酸 28 圖5 :AQC和胺基酸的衍生反應示意圖 29 圖6 :鄰苯二甲醛方法分析標準胺基酸 30 圖7 :鄰苯二甲醛和胺基酸的衍生反應示意圖 30 圖8 :異硫氰酸異丁酯方法分析胺基酸 31 圖9 :異硫氰酸異丁酯和標準胺基酸反應示意圖 31 圖10:異硫氰酸苯酯和胺基酸反應的示意圖 32 圖11:異硫氰酸苯酯HPLC分析圖 32 圖12:二甲胺基磺醯氯方法分析胺基酸 34 圖13:二甲胺基磺醯氯和標準胺基酸反應示意圖 34 圖14:Ninhydrin方法分析胺基酸 35 圖15:Ninhydrin方法分析胺基酸示意圖 36 圖16:BL21(DE3)Ampr Camr, 生長曲線 71 圖17: IPTG誘導濃度測試 72 圖18: 誘導後藍藻蛋白在菌中含量隨時間變化 73 圖19: 產物蛋白質電泳 74 圖20: 標準蛋白質移動距離和分子量的關係 75 圖21: 標準胺基酸HPLC分析圖 76 圖22:藍藻蛋白HPLC分析圖 77 圖23:藍藻蛋白TG圖 78 圖24:藍藻蛋白FTIR,溴化鉀碇片法 79 圖25:藍藻蛋白成膜後的減弱全反射法,溶劑為0.1N HCl 80 圖26:藍藻蛋白成膜後的減弱全反射法,溶劑為0.1N HCl:甲醇=1:1 81 圖27:藍藻蛋白DSC圖 82 圖28:藍藻蛋白DSC圖,外加胺基酸為0.06mol/L 83 圖29:藍藻蛋白DSC圖,外加胺基酸為0.12mol/L 84 圖30:藍藻蛋白DSC圖,外加胺基酸為0.18mol/L 85 圖31:藍藻蛋白DSC圖,外加胺基酸為0.24mol/L 86 圖32:外加胺基酸的產率變化圖 87 圖33:外加胺基酸藍藻蛋白電泳圖 87 圖34:外加胺基酸的藍藻蛋白蛋白質電泳圖 89 圖35:外加不同比率胺基酸的蛋白質電泳圖 90 圖36:外加胺基酸比率為Asp:Arg=4:1的藍藻蛋白的DSC圖 91 圖37:外加胺基酸比率為Asp:Arg=1:4的藍藻蛋白的DSC圖 92 表目錄 表格 1 :Simon and Weather method和酸萃取方法的比較 26 表格 2 :實驗藥品清單 38 表格 3 :實驗儀器設備清單 41 表格 4 :HPLC溶劑梯度表 47 表格 5 :外加胺基酸的濃度和加入體積 48 表格 6 :外加不同比率胺基酸的濃度和加入體積 50 表格 7 :大腸桿菌的生長時間和OD值關係表 54 表格 8 :標準蛋白質分子量和移動距離的關係表 56 表格 9 :DSC熔點的整理 61 表格 10:成膜後的接觸角測量 62 表格 11:外加胺基酸提升產率的關係表 63 表格 12:改變外加胺基酸莫耳比率的DSC圖 65

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無法下載圖示 全文公開日期 2014/08/04 (校內網路)
全文公開日期 本全文未授權公開 (校外網路)
全文公開日期 本全文未授權公開 (國家圖書館:臺灣博碩士論文系統)
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